1．樣本處理

蛋白質(zhì)樣本首先經(jīng)過離心（4 ℃，15000 r/min 離心 30 分鐘）除去不溶物，再經(jīng) SDS 上樣緩沖液 100 ℃ 變性 3～5 分鐘，使帶有強負電荷的 SDS 與帶有較弱電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，大量 SDS 可掩蓋蛋白質(zhì)自身的電荷量，只顯示 SDS 的負電荷，在 pH8.6～pH8.8 的 Tris-甘氨酸不連續(xù) SDS-PAGE 系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的泳動與自身電荷量無關(guān)，只和其分子大小有關(guān)，從而將蛋白質(zhì)按分子量大小順序分離。

電泳樣品中總蛋白質(zhì)濃度不能超過凝膠系統(tǒng)的裝載能力，可采用微型電泳系統(tǒng)時，每一個加樣孔內(nèi)的總蛋白量不能大于 5 μg，目的蛋白量在 10 ng 左右較好，蛋白量過高將出現(xiàn)拖尾或蛋白帶融合現(xiàn)象。蛋白質(zhì)樣本如經(jīng)過濃縮，須用合適緩沖液透析除鹽后上樣，否則在高鹽狀態(tài)下電泳將出現(xiàn)電泳帶扭曲的現(xiàn)象。

2．凝膠選擇

根據(jù)目的蛋白質(zhì)分子大小選擇合適的凝膠濃度，一般情況下，用于免疫印跡的 SDS-PAGE 凝膠濃度與所分離的蛋白質(zhì)分子量間的關(guān)系如表 1 所示。為提高樣本分辨率，通常采用高一級凝膠濃度的電泳系統(tǒng)，將獲得更好的結(jié)果。

表 1 凝膠濃度與蛋白分子量的關(guān)系

為使電泳后蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移至固相支持膜上，還須考慮凝膠的濃度及厚度。凝膠的百分含量和交聯(lián)度越低，轉(zhuǎn)移越容易，最軟的凝膠可產(chǎn)生好的轉(zhuǎn)移效率，但凝膠濃度過低可導(dǎo)致電泳帶變寬、融合，降低分辨率。凝膠越薄，轉(zhuǎn)移效率也就越高，但過薄的凝膠易碎，導(dǎo)致操作困難。多數(shù)情況下采用 0.5～1 mm 厚凝膠，為提高蛋白上樣量和檢測敏感度，可適當(dāng)增加凝膠厚度，但不宜超過 2 mm。

3．蛋白質(zhì)標準品選擇蛋白質(zhì)凝膠電泳需要蛋白質(zhì)標準品（molecular weight marker）指示系統(tǒng)，來顯示電泳的分離效率、轉(zhuǎn)膜效率以及樣本泳動情況。SDS-PAGE 凝膠電泳如采用普通蛋白質(zhì)標準品，須經(jīng)蛋白質(zhì)染色后才能確認上述電泳參數(shù)，故問題發(fā)現(xiàn)不及時，常常導(dǎo)致無效的重復(fù)電泳。彩色標準品（rainbow marker）可彌補這一欠缺，如表 2 所示，該 Marker 在電泳凝膠中隨蛋白質(zhì)的遷移，各分子量條帶逐漸分開，并顯示多種色彩的條帶，可直接肉眼觀察泳動及分離情況，當(dāng)目的分子量大小的 Marker 遷移到合適位置（距凝膠底部 1/3 處），同時其與相鄰兩條 Marker 達到足夠分辨距離時，即可停止電泳，取出凝膠。蛋白質(zhì)樣本轉(zhuǎn)膜后的轉(zhuǎn)膜效率和目的蛋白質(zhì)分子量，均可通過彩色標準品直接推算。

1）安裝電泳裝置和玻璃板。

2）配制分離膠：按照所需濃度和體積依次混合 H2O，30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10% SDS，10% 過硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。

3）迅速在兩玻璃板間隙灌入分離膠溶液，留出沉積膠所需體積和梳子齒長高度。小心地在膠上覆蓋一層去離子 H2O，垂直放置于室溫中，約 30 分鐘使膠凝聚。

4）倒出分離膠上方覆蓋液體，盡量吸干。

5）配制 5% 濃縮膠，依次混合 H20，30% 丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris（pH8.8），10% SDS，10% 過硫酸銨，最后加入 TEMED，立即快速混勻。

6）在分離膠上方灌入濃縮膠，并插入梳子，避免氣泡！再灌入適量濃縮膠填滿梳子齒間縫隙，垂直放置于室溫。

7）將蛋白樣品加入等量 2X SDS 加樣緩沖液，100 ℃ 加熱 3 分鐘使蛋白變性。2000 r/min，常溫離心 3 分鐘。

8）取出濃縮膠中梳子，以 H2O 去除未聚合丙烯酰胺。將凝膠裝置固定于電泳裝置中，在上、下槽均加滿 Tris-Glysine 電泳緩沖液。

9）加樣 10～20 μl。

10）將電泳裝置通電，電壓 8V/cm，當(dāng)染料前沿進入分離膠后，電壓提高到 15V/cm，電泳至溴酚藍到達膠底部，約 2～4 小時。