免疫熒光三標(biāo)四色（芯片）

服務(wù)介紹：　　

組織芯片的免疫熒光檢測(cè)，是將許多不同個(gè)體組織標(biāo)本以規(guī)則微陣列方式排布于同一載玻片上，同時(shí)進(jìn)行相同指標(biāo)的免疫熒光檢測(cè)。組織芯片熒光三標(biāo)實(shí)驗(yàn)室在同一張組織芯片上對(duì)三個(gè)抗原進(jìn)行同時(shí)標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測(cè)，標(biāo)本體積小, 標(biāo)本信息含量大 , 一次性實(shí)驗(yàn)即可獲大量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件更易控制一致，減少批間批內(nèi)誤差，結(jié)果更準(zhǔn)確。

實(shí)驗(yàn)流程：

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-無(wú)水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2. 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定）

3. 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4. 血清封閉:在圈內(nèi)滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來(lái)源，則加兔血清）

5. 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6. 加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7. 加CY3熒光增強(qiáng)劑：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加CY3熒光增強(qiáng)劑，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min

8. 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。

9. 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

10. 加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11. 加FITC熒光增強(qiáng)劑：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加FITC熒光增強(qiáng)劑，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min

12. 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。

13. 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

14. 加CY5標(biāo)記的熒光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的CY5標(biāo)記熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

15. DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

16. 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

17. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

18. 鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光. CY5激發(fā)波長(zhǎng) 608-648nm, 發(fā)射波長(zhǎng)672-712,，CY5原本為正紅色，為了與CY3區(qū)分開(kāi)，我們?cè)O(shè)定為粉色光。 DAPI染出來(lái)的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光，粉光，綠光 。

送樣運(yùn)輸要求：

1、樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運(yùn)輸送樣。切勿固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切勿冷凍結(jié)冰。

2、熒光三標(biāo)只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片。